ANÁLISIS DE CALIDAD DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Cuantificación de ácidos nucleicos mediante absorbancia (Nanodrop) o fluorimetría (Qubit 3.0).

Análisis de tamaño, concentración e integridad de ácidos nucleicos mediante electroforesis automatizada de alto rendimiento con TapeStation 4200 (Agilent) y Bionalizador 2100  (Agilent). Genera estándares de integridad para ARN (RIN), ADN genómico (DIN) y ADN libre circulante (% cfDNA).

Ensayos disponibles: RNA, RNA HS, DNA 1000, DNA 1000 HS, DNA5000, DNA 5000 HS, cfDNA, Genomic DNA para TapeStation 4200 y  RNA 6000 Nano, RNA 6000 pico y RNA small para Bioanalizador 2100.

Escalabilidad de 1 a 96 muestras por carrera con coste constante por muestra. El tiempo de realización de esta técnica es de 1 a 2 minutos por muestra, permitiendo suministrar los resultados a los investigadores incluso el mismo día de recepción de las muestras.

PCR  A  TIEMPO REAL

La PCR a Tiempo Real es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos. Incluso con una cantidad mínima de molde, el sistema garantiza una alta sensibilidad, especificidad y eficiencia. La Plataforma de Genómica dispone del equipo QuantStudio 5 (Applied Biosystems) con un bloque de 384 pocillos, seis filtros de excitación y seis emisiones. Los filtros ofrecen 21 combinaciones diferentes de colores permitiendo una amplia gama de fluoróforos de detección y multiplexación máxima. La conexión a ThermoFisher Cloud permite acceder, compartir y analizar los datos en cualquier momento y desde cualquier lugar.

El tiempo de realización de esta técnica es variable en función del número de muestras o cantidad de genes a analizar. Una vez se diseña el experimento, se establece un presupuesto y un plazo de entrega de los resultados.

Software  disponible:  gratuito a través de Thermofisher Cloud.

Aplicaciones:  análisis de expresión génica (mRNA), genotipado con sondas KASP y Taqman,  perfiles y cuantificación de microRNAs, detección de patógenos y cuantificación de la carga viral como SARS-Cov2.

SECUENCIACIÓN SANGER        

Los productos de PCR se secuencian con dideoxinucleótidos marcados con cuatro fluorocromos diferentes (BigDye Terminator v3.1). Los productos de la secuenciación son separados de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis capilar en un analizador genético ABI 3500 (Applied Biosystems).

Software  disponible: SeqScape v 2.5; GeneMapper v 3.7.

Aplicaciones: secuenciación de ADN, detección específica de mutaciones, análisis de fragmentos para identificación humana (forense), análisis de microsatélites e indels, Quantitative Fluorescence PCR (QF-PCR) y Multiplex Ligation-depndent Probe Amplification (MLPA).

SECUENCIACIÓN MASIVA

La Plataforma de Genómica ofrece dos tecnologías con diferentes capacidades y rendimientos  según las necesidades de cada proyecto.

PGM / S5 (Ion Torrent): rango de pocos miles hasta 130 Millones de lecturas.

NextSeq 2000 (Illumina): desde 100 M a 1,2 B de lecturas.

El servicio proporciona soporte técnico completo en las siguientes tareas:

• Asesoramiento en la estrategia a desarrollar según las necesidades del proyecto, diseño de paneles personalizados y presentación de un presupuesto orientativo.
• Generación de las librerías para su secuenciación.
• Controles de calidad a lo largo de todo el proceso de secuenciación masiva.
• Análisis bioinformático primario y secundario de los datos generados.

El tiempo de ejecución de la secuenciación masiva dependerá del número de muestras a analizar y de la aplicación solicitada, como mínimo se establecen  20 días  para el desarrollo del proceso.

Software  disponible: Ion Reporter 5.20.0.0 gratuito a través de ThermoFisher Cloud. Paquetes de análisis secundario integrados en Dragen 3.10.12 (Illumina)

Secuenciación ADN

- Exoma humano completo (WES) incluyendo  37.5 Mb regiones codificantes.  

- Secuenciación de amplicones:

• Paneles comerciales validados en múltiples áreas de investigación para la detección de variantes en análisis germinal o somático.
• Configuración de paneles dirigidos  para la investigación de enfermedades humanas a partir de un catálogo de genes optimizados para análisis germinal.
• Diseño de paneles custom sobre cualquier organismo para la secuenciación de  genes, regiones, hotspots, análisis de expresión o detección de genes de fusión.
• Paneles HD: Ensayos de alta sensibilidad (LOD < 0.1%) para biopsia líquida y oncología somática.
• Paneles Oncomine: análisis de SNVs, indels, CNVs y genes de fusión.

Secuenciación ARN

- ARNm con orientación de cadena (stranded): secuenciación del ARNm que codifica proteínas. Identificación de genes sobreexpresados y subexpresados, nuevos transcritos y productos de fusión dentro del transcriptoma.

- RNA Total incluyendo depleción de RNA ribosómico: secuenciación de todo el ARN codificante y no codificante dentro de una muestra después de la eliminación del ARNr. Además, también se puede eliminar el ARN mitocondrial. Para muestras de humano, ratón, rata, bacterias gram-positivas, bacterias gram-negativo, hojas de planta, semillas y raíz.

- Small RNA: secuenciación de RNA pequeños y microRNAs que se expresan dentro de una muestra para identificar el silenciamiento y regulación génica post-transcripcional.

Secuenciación microbiota

- Análisis de la diversidad bacteriana mediante secuenciación del 16S rRNA

- Análisis de la diversidad genética en una muestra, incluyendo bacterias, arqueas y hongos (ITS1/ITS2)

- Secuenciación de cepas bacterianas

- Shotgun metagenómica

MICROARRAYS

Plataforma para la hibridación y análisis de microarrays de DNA (Agilent Technologies) equipada con DNA Microarray Scanner with Surescan High Resolution Technology (3 µm). Los microarrays de Agilent consisten en portas de vidrio con miles (K) de sondas de DNA impresas (Agilent 60-mer SurePrint Technology) correspondientes a los genes de una especie, y permiten obtener una cuantificación de los ácidos nucleicos (DNAs o RNAs) presentes en las muestras experimentales, que son marcados con fluorescencia mediante hibridación con las sondas. Cada microarray es para una sola muestra y un sólo uso. Los microarrays están diseñados en función de la aplicación y de la especie.

El tiempo de ejecución dependerá del número de muestras a analizar, como mínimo se establece un periodo mínimo de 15 días una vez se hayan recibido los microarrays en el laboratorio.

Aplicaciones: Microarrays de expresión génica, análisis de miRNAs y  análisis de variantes de splicing.

PIROSECUENCIACIÓN

El análisis cuantitativo de la metilación de sitios CpG específicos en cualquier genoma se realiza mediante pirosecuenciación con el sistema Pyromark Q24 (Qiagen). Se utilizan ensayos predefinidos o de nuevo diseño mediante Pyromark Assay Design Software (Qiagen). Junto a las muestras experimentales, se incluyen controles de DNA 100% metilado y no metilado. Previamente a la pirosecuenciación se realiza tratamiento con bisulfito sódico para la conversión de las citosinas no metiladas en uracilos, seguido de amplificación de los fragmentos diana mediante PCR usando primers específicos. La conversión con bisulfito y la PCR se incluyen en el servicio. 

El tiempo de ejecución de la pirosecuenciación dependerá del número de muestras a analizar, requiriéndose al menos dos semanas para la conversión con bisulfito, PCRs y pirosecuenciación.

CITOGENÉTICA

El Centro de Bioquímica y Genética Clínica de la DGAS del Servicio Murciano de Salud ofrece además los siguientes servicios:

• Análisis de anomalías cromosómicas mediante el estudio del Cariotipo convencional constitucional.
• Hibridación in situ Fluorescente (FISH) en extensiones celulares.
• Microarray de Hibridación Genómica Comparada (CGH) para análisis de variaciones en número de copias (CNVs) con software de análisis Cytogenomics v5.2 (Agilent Technologies, Inc.). Disponibilidad inmediata en formato de 8x60 y diseño ISCA v2 o empleo de otros diseños y formatos según demanda y tras acuerdo.

El tiempo de ejecución dependerá del número de muestras a analizar y la disponibilidad del personal especializado del Centro de Bioquímica y Genética Clínica.